综合分析了影响茉莉花原生质体分离的主要因素,建立了茉莉花花瓣原生质体的瞬时转化体系。试验流程为：以温室或自然环境中生长并盛开的花原茉莉花朵为材料,取其充分展开的花瓣为外植体(图6-A),用刀片将花瓣切割到足够纤细且均匀,移至含15G·1-1纤维素酶,4G·1-1离析酶和8G·1-1果胶酶的酶解混合液中,每5m1酶解液可酶解约0.5G花瓣量(图6-B),酶解5h,过滤收集到的原生质体经过清洗和沉淀,可获得明显的原生质体聚集层(图6-C)。用mmG溶液将收集到的生质时表原生质体稀释至浓度为4×105个·m1-1,按75μG·m1-1原生质体的比例加入含GFP标签的外源质粒dnA,再加入等体积的400G·1-1PEG溶液,混匀后,室温诱导约5min,转化后的原生质体暗处孵育16h后,在荧光显微镜下可观察到发出绿色荧光信号的原生质体(图6－E),说明含GFP荧光蛋白标签的质粒可高通量导入茉莉花花瓣原生质体,并得到稳定表达。
进一步利用含有转录因子Js1hY-GFP融合载体,体瞬进行目标基因的原生质体表达研究。以P35s-GFP空载体为对照,达体分别转入茉莉花瓣原生质体后,通过激光共聚焦显微镜扫描检测它们的亚细胞定位。观察显示GFP表达载体转入花瓣原生质体后,建立及其细胞核、细胞质和细胞膜等部位均有明显绿色荧光信号,茉莉这与其他植物原生质体转化中观察到的结果一致,而转入Js1hY-GFP融合载体的花瓣原生质体产生的绿色荧光信号主要集中在细胞核中(图7),说明转录因子Js1hY定位于茉莉花细胞的细胞核中行使功能。
为检验茉莉花来源的蛋白在茉莉花原生质体和异源表达体系中的亚细胞定位是否一致,本研究选择了茉莉花的2个糖转运蛋白家族成员JssWEET1和JssWEET17,采用上述优化建立的茉莉花花瓣原生质体瞬时转化系统来分析它们的亚细胞分布,同时以拟南芥叶片原生质体系统作为对照。由于白色花瓣原生质体中不含叶绿体,生质时表无法检测到叶绿体产生的自发荧光,激光共聚焦显微镜观察结果显示,JssWEET1-GFP融合蛋白分布于茉莉花瓣原生质体细胞膜上,同时在胞质中有明显的斑点状分布,而在拟南芥叶肉原生质体中JssWEET1-GFP主要以斑点状分布于细胞质中(图8-A和C)。JssWEET17-GFP在茉莉花瓣原生质体和拟南芥叶片原生质体中均主要分布于细胞质或胞质内膜系统中(图8－B和d)。体瞬
茉莉花作为一种有重要经济价值的达体花卉植物,由于其转基因技术的缺少使得其在遗传转化等方面的研究极其困难,而使用原生质体进行瞬时转化则在一定程度上克服了这一障碍。目前,建立及关于茉莉花原生质体制备方法的研究尚未见报道。因此,茉莉本研究在借鉴拟南芥原生质体制备的基础上,探索了茉莉花植株上适合分离出原生质体的组织器官,系统地改良了其原生质体的制备条件和转化条件,获得了拥有较高数量和活力的花瓣原生质体,并表现出较好的转化效果。茉莉花花瓣原生质体转化体系的花原建立,为茉莉花基因和蛋白的研究提供了快捷且更有针对性的受体材料和实验平台,避免了利用其他模式植物瞬时转化体系可能带来的表达或定位紊乱,使得研究结果更具说服力。
获得高质量的生质时表植物原生质体,需要考虑到合适的外植体、酶液组合与浓度、酶解时间和酶液渗透压等关键因素,幼嫩外植体常是分离原生质体的最佳材料,研究表明,盛开的茉莉花花瓣相较于叶片具备组织幼嫩、细胞排列松散等特点,更适合作为原生质体游离的材料。本研究还发现果胶酶对茉莉花花瓣原生质体的分离有关键作用,当酶液中缺少果胶酶时游离出的原生质体数量稀少,而在纤维素酶、离析酶和果胶酶同时使用时,原生质体产量有明显改善。经综合分析,本试验中分离茉莉花瓣原生质体的最适宜酶类组合为：15G·1-1纤维素酶＋4G·1-1离析酶＋8G·1-1果胶酶,最优酶解时间为5h。
由于可以清晰看见其细胞膜与细胞器,使原生质体在蛋白亚细胞定位上更具有优势,利用原生质体进行简易的基因瞬时表达及亚细胞定位是当前研究植物分子与细胞生物学中最常用且高效的方法。本实验室在研究茉莉花开花过程相关功能基因时,鉴定到一系列在茉莉花瓣中特异性高度表达的基因,采用已建立的茉莉花瓣原生质体表达系统,成功鉴定了拟南芥生物钟调控转录因子AT1hY在茉莉花中的同源蛋白Js1hY具有细胞核定位特性。此外,茉莉花的糖转运蛋白家族可能介导跨细胞膜的糖运输与储存,其家族多个成员在开花过程中表达量显著上调,烟草叶片瞬时表达显示它们多分布于细胞膜或胞质内膜中,研究也表明,JssWEET1-GFP和JssWEET17-GFP分别定位于茉莉花瓣原生质体的细胞膜和细胞质中,同时JssWEET1-GFP还以斑点状分布于细胞质中,猜测其可能通过高尔基体或囊泡等细胞器参与糖分运输,这些结果意味着它们介导的生物学功能发生在不同的细胞器中。在拟南芥叶片原生质体中,JssWEET17-GFP的分布与其在茉莉花瓣原生质体中的定位基本一致,而JssWEET1-GFP在细胞膜上定位信号较弱,主要以斑点状分布于胞质中,说明其亚细胞分布可能具有组织细胞特异性。
相较于成熟的拟南芥叶肉原生质体瞬时表达体系,本研究中茉莉花瓣原生质体的活性和转化率还有待提升,不过由于栽培容易、自然盛开的茉莉花瓣容易收集、酶解时间短等优点,使得花瓣原生质体的分离和转化试验可在1d内完成,有效促进了某些基因功能的研究分析。受限于组织特异性,花瓣原生质体中不含叶绿体,所以研究与叶绿体相关的蛋白或基因可能需要共转化对照质粒,未来对茉莉花叶片的原生质体分离体系仍需进一步优化。
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